Geboren in Oss, Nederland, op 1 juli 1976, begon Van Nistelrooy zijn voetbalcarrière bij FC Den Bosch. Na indruk te hebben gemaakt bij de Brabantse club, verhuisde hij naar sc Heerenveen, waar hij zijn doelpunteninstinct verder ontwikkelde.
In 1998 maakte Van Nistelrooy de overstap naar PSV Eindhoven, waar hij echt tot bloei kwam. In twee seizoenen bij de Eindhovenaren scoorde hij 72 goals in 91 wedstrijden, waarmee hij een sleutelrol speelde in de landstitel van PSV in 2000.
Zijn prestaties bij PSV trokken de aandacht van Manchester United, die hem in 2001 binnenhaalde voor een recordbedrag van 19 miljoen pond. Op Old Trafford werd Van Nistelrooy al snel een publiekslieveling. Met zijn trefzekere optredens hielp hij United aan drie Premier League-titels (2003, 2007, 2009), een FA Cup (2004) en de League Cup (2006).
Na zes succesvolle jaren bij United verhuisde Van Nistelrooy in 2006 naar Real Madrid. Ook in de Spaanse hoofdstad bleef hij scoren als nooit tevoren. In zijn vier seizoenen bij Real Madrid won hij twee La Liga-titels (2007, 2008) en scoorde hij 126 goals in 200 wedstrijden.
Na Real Madrid speelde Van Nistelrooy nog kort voor Hamburger SV in Duitsland en Málaga CF in Spanje, alvorens in 2012 een punt te zetten achter zijn indrukwekkende carrière.
Van Nistelrooy was niet alleen een doelpuntenmachine voor zijn clubs, maar ook voor het Nederlands elftal. In 70 interlands scoorde hij 35 goals, waarmee hij de vijfde topscorer aller tijden van Oranje is.
Na zijn pensionering als speler werd Van Nistelrooy assistent-trainer bij Oranje en hoofdtrainer van Jong PSV. In 2022 werd hij aangesteld als hoofdtrainer van Manchester United, waar hij de opvolger is van Ole Gunnar Solskjær.
Van Nistelrooy, bekend om zijn onverzettelijkheid, koelbloedigheid en enorme doelpunteninstinct, zal voor altijd worden herinnerd als een van de beste spitsen van zijn generatie. Zijn naam staat synoniem aan doelpunten, overwinningen en voetbalgeschiedenis.